DNA-Polymerase

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DNA-Polymerase mit Korrekturlese-Funktion (engl. proof-reading).

DNA-Polymerasen, genauer DNA-abhängige DNA-Polymerasen, sind Enzyme, welche die Synthese von DNA aus Desoxyribonukleotiden an einer DNA-Matrize katalysieren. DNA-Polymerasen spielen eine Schlüsselrolle bei der DNA-Replikation.

Biochemische Aspekte

Polymerase-Aktivität

Die Polymerase ermöglicht die chemische Verknüpfung von einzelnen Molekülen (Monomere) zu einer Kette (Polymer). Im Falle der DNA-Polymerase ist das gebildete Polymer die Desoxyribonukleinsäure (DNS), als Monomere dienen Desoxyribonukleotide, genauer Desoxy-Nukleosidtriphosphate (dNTPs). Die DNA-Polymerase nutzt stets einen bereits bestehenden DNA-Einzelstrang als Matrize (Vorlage) für die Synthese eines neuen, komplementären Stranges, dessen Nukleotid-Abfolge somit von der Matrize bestimmt wird. Dieser Erhalt der DNA-Sequenz ist entscheidend für die Fähigkeit der DNA-Polymerase, die in der DNA codierte Erbinformation zu kopieren. Das korrekte Kopieren der Matrize gelingt durch komplementäre Basenpaarung der eingebauten Nukleotidbasen mit den Basen der DNA-Matrize, vermittelt durch Wasserstoffbrücken. Die Synthese des neuen DNA-Stranges erfolgt vom 5'- zum 3'-Ende. Chemisch betrachtet findet dabei ein nukleophiler Angriff der endständigen 3'-Hydroxygruppe des DNA-Stranges auf das α-Phosphat des dNTPs statt, wobei Pyrophosphat freigesetzt wird. Dieser Schritt wird von der Polymerase katalysiert.

Im Gegensatz zu RNA-Polymerasen kann die Synthese des komplementären DNA-Stranges bei DNA-Polymerasen nur erfolgen, wenn der Polymerase ein freies 3'-Hydroxyende zur Verfügung steht. An dieses wird dann das erste Nukleotid angehängt. Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nutzt man hierzu einen ca. 15–20 Nukleotide langen DNA-Einzelstrang (Primer), der als Startpunkt der Reaktion dient. DNA-Polymerasen benötigen in der Regel Magnesium-Ionen als Kofaktor.

Die Katalyse der Bildung der Diesterbindung erfolgt funktionell analog zu der entsprechenden Reaktion der RNA-Polymerasen. Das letzte Nukleotid des bereits synthetisierten Abschnittes und das anzufügende Nukleotid sind an jeweils eines von zwei Magnesium-Ionen im katalytischen Zentrum der Polymerasendomäne koordiniert. Die erste Phosphatgruppe des anzufügenden Nukleotids ist an beide Magnesium-Ionen koordiniert. Die räumliche Lage ermöglicht einen Angriff der Hydroxygruppe des vorangegangenen Nukleotids auf die Phosphatgruppe des anzufügenden. Dabei wird ein Pyrophosphatrest abgespalten.

Exonuklease-Aktivität

Viele Polymerasen haben zusätzlich noch weitere Enzym-Funktionen. In Anwesenheit geringer Konzentrationen an dNTPs überwiegt die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität. Einige Polymerasen besitzen auch eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität. Um zu gewährleisten, dass es zu keinen Fehlern beim Ablesen der DNA-Matrize kommt, verfügen sie über diese Korrekturlese-Funktion (engl. proof reading), d. h., sie sind in der Lage, den Einbau eines unpassenden Nukleotids zu erkennen und dieses anschließend wieder aus der DNA zu entfernen. Diese ermöglicht den Abbau eines bestehenden DNA- oder RNA-Stranges, der bereits mit dem Matrizenstrang gepaart ist, während ein neuer Strang gebildet wird. Es resultiert ein Austausch des alten Stranges gegen einen neuen Strang. Diese Exonuklease-Aktivität wird bei der Methode der nick translation ausgenutzt.

Verschiedene DNA-Polymerasen

In Bakterien, wie etwa Escherichia coli gibt es drei verschiedene Polymerasen. Eine davon, die DNA-Polymerase I (Pol I) wurde im Jahr 1955 von Arthur Kornberg isoliert und war die erste Polymerase überhaupt, die entdeckt wurde. Diese ist aber nicht die für die Replikation wichtigste Polymerase in E. coli, da sie nur etwa 20 Syntheseschritte katalysiert (d. h., sie besitzt nur eine niedrige Prozessivität). DNA-Polymerase II und DNA-Polymerase III, die anderen beiden DNA-Polymerasen in E. coli, wurden erst 15 Jahre nach der Entdeckung der DNA-Polymerase I isoliert, nachdem sich E. coli-Mutanten mit Defekt im Polymerase I Gen dennoch als replikationskompetent erwiesen. Diese Mutanten waren allerdings besonders anfällig gegenüber UV-Strahlung und alkylierenden Substanzen, weshalb man annimmt, dass die DNA-Polymerase I vorwiegend Reparaturaufgaben übernimmt. Die Polymerase III, die in E. coli die eigentliche Replikation durchführt, ist aus insgesamt sieben Untereinheiten aufgebaut und kommt pro Bakterienzelle nur in sehr wenigen Kopien vor.

In Säugern kommen fünf DNA-Polymerasen vor. DNA-Polymerase α, β, γ, δ und ε. Es wird angenommen, dass es sich bei den für die Replikation entscheidenden um die Polymerasen δ und ε handelt, die sich durch hohe Prozessivität und Korrekturlesefunktion (proof reading) auszeichnen. Die Polymerasen α und β zeigen dagegen nur geringe Prozessivität und keine Proofreadingfunktion. Die Polymerase γ tritt nur in Mitochondrien auf.

RNA-abhängige DNA-Polymerasen werden als Reverse Transkriptase bezeichnet.

Biologische Bedeutung

DNA-Polymerasen sind von zentraler Bedeutung für die DNA-Replikation. Sie ermöglichen das getreue Kopieren der Erbinformation in Form von DNA, somit einen entscheidenden Schritt bei der Vermehrung und Fortpflanzung von Lebewesen. DNA-Polymerasen spielen zudem bei Vorgängen, die mit der Reparatur von DNA einhergehen, eine wichtige Rolle.

Biotechnologische Bedeutung

Im Labor werden DNA-Polymerasen oft für die Polymerase-Kettenreaktion und verwandten Methoden (z. B. RT-PCR, qPCR), bei der Nick translation, beim Random priming und bei der DNA-Sequenzierung eingesetzt. Dabei kommt eine Vielzahl von verschiedenen, teils per Protein-Engineering veränderten thermostabilen DNA-Polymerasen zum Einsatz (z. B. Taq-Polymerase). Neben einer hohen Temperaturstabilität bringen thermostabile DNA-Polymerasen archaeischen Ursprung wie die Pfu-Polymerase eine Korrekturlese-Funktion (proof-reading) mit, da es bei der PCR zu keiner Veränderung der erzeugten DNA kommen soll. Weiterhin werden in verschiedenen Methoden der isothermalen DNA-Amplifikation bei Raumtemperatur strangversetzende DNA-Polymerasen wie die φ29-DNA-Polymerase. Der Vorläufer der heute verwendeten DNA-Polymerasen war die T4-DNA-Polymerase.

Literatur

• Lehninger; David Nelson, Michael Cox: Lehninger Biochemie. 3. Auflage, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2001, ISBN 3-540-41813-X
• Wilhelm Seyffert: Lehrbuch der Genetik. 2. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin 2003, ISBN 3-8274-1022-3
• Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer: Biochemie 6. Auflage, Springer-Verlag, Heidelberg 2007, ISBN 978-3-8274-1800-5

Weblinks

• PDB Molecule of the Month: DNA Polymerase